M-NFS-60小鼠骨髓性白血病細(xì)胞

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常會(huì)遇到很多問(wèn)題，為解救細(xì)胞，就得對(duì)癥下藥才行。一般細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題的原因可以從5個(gè)方面來(lái)著手。只要抓住這5點(diǎn)，救細(xì)胞就是小case。

細(xì)胞自身問(wèn)題

如果你使用的細(xì)胞已經(jīng)是很多代之后的了，培養(yǎng)的時(shí)候就會(huì)力不從心，可以重新復(fù)蘇更原始的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

 如果你使用的是凍存的細(xì)胞，那就有可能在凍存時(shí)該細(xì)胞的增殖能力就很弱了，可以通過(guò)查看以往的操作記錄來(lái)判斷。

還有一點(diǎn)就是個(gè)體差異，可以在培養(yǎng)前通過(guò)已知的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣本進(jìn)行篩選，從而減少個(gè)體差異帶來(lái)的影響。

外源污染

如果相同來(lái)源的其它批次的細(xì)胞并沒(méi)有出現(xiàn)問(wèn)題，你就要思考一下你是不是“中獎(jiǎng)了”。請(qǐng)及時(shí)對(duì)可疑細(xì)胞以及培養(yǎng)使用的試劑進(jìn)行隔離。

細(xì)菌污染

細(xì)菌是一種原核細(xì)胞微生物，其大小以微米(μm)計(jì)。

常見(jiàn)的污染細(xì)菌有革蘭氏陰性菌和大腸桿菌、假單胞菌等，革蘭氏陰性菌中白色葡萄球菌等比較常見(jiàn)。

一旦發(fā)生細(xì)菌污染較易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象；有時(shí)靜置的培養(yǎng)液液體初看不混濁，但稍加振蕩，就有很多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。必要時(shí)可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以證實(shí)細(xì)菌種類；有的培養(yǎng)液改變不明顯而又疑有污染，可取出少量培養(yǎng)液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可取10ml細(xì)胞懸液以100rpm離心5min，沉淀中加入無(wú)抗生素的培養(yǎng)液2ml，置于37℃培養(yǎng)，24h可得結(jié)果。

污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，后變圓脫落死亡，造成試驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)丟失。

解決方案：

(1) 丟棄所有已經(jīng)污染的細(xì)胞和培養(yǎng)基；

(2) 培養(yǎng)環(huán)境用新潔爾滅擦拭且UV滅菌24小時(shí)；

(3) 培養(yǎng)試劑中加入P/S雙抗；

(4) 盡可能使用一次性耗材及成品培養(yǎng)基；

真菌污染

真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中很常見(jiàn)的一種，尤其在梅雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。

污染培養(yǎng)細(xì)胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。

霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見(jiàn)，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微鏡下可見(jiàn)于細(xì)胞之間縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀、管狀、及樹(shù)枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡可見(jiàn)到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長(zhǎng)。鏡下看時(shí)，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長(zhǎng)的菌絲相混淆。

真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。

解決方案：

(1) 丟棄所有已經(jīng)污染的細(xì)胞和培養(yǎng)基；

(2) 培養(yǎng)環(huán)境用甲醛熏蒸；

(3) 培養(yǎng)試劑中加入兩性霉素B；

(4) 盡可能保持細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的干燥；

(5) 注意戴帽子和K罩；

(6) 盡可能使用一次性耗材及成品培養(yǎng)基；

支原體污染

支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間(小直徑0.2μm并獨(dú)立生活的微生物。約有1%可通過(guò)濾菌器。支原體無(wú)細(xì)胞壁形態(tài)呈高度多形性．可為圓形、絲狀或梨形。

支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。電鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)．其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無(wú)顆粒群或中央束。

支原體代謝需固醇類物質(zhì)、部分種類需要精氨酸、氧氣、葡萄糖，每一種支原體都有自身持點(diǎn)。多數(shù)支原體適合于偏堿條件下生存(PH 7.6~8.0)，對(duì)酸耐受性差。對(duì)熱比較敏感，對(duì)一般抗生素不敏感。
支原體污染細(xì)胞后．培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁．多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著，細(xì)微變化也可由于傳代、換液而緩解．因此易被忽視。但個(gè)別嚴(yán)重者，可致細(xì)胞增殖緩慢．甚至從培養(yǎng)器皿脫落。

解決方案：

(1) 丟棄所有已經(jīng)污染的細(xì)胞和培養(yǎng)基；

(2) 使用支原體清除試劑擦拭培養(yǎng)箱及超凈工作臺(tái)；

(3) 培養(yǎng)試劑中加入支原體清除試劑；

(4) 注意戴帽子和K罩；

(5)盡可能使用一次性耗材及成品培養(yǎng)基；

黑膠蟲(chóng)污染

黑膠蟲(chóng)可以穿透濾膜，也可以通過(guò)空氣傳播，低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍下可看見(jiàn)黑色的小蟲(chóng)游來(lái)游去，培養(yǎng)液不渾濁，一般不會(huì)太影響，細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且觀測(cè)到的運(yùn)動(dòng)物無(wú)明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無(wú)明顯變化，可在同一批號(hào)的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。數(shù)量不多的時(shí)候?qū)?xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不會(huì)有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會(huì)自然消失，除更換血清外無(wú)須特殊處理。

原蟲(chóng)污染

培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細(xì)小的點(diǎn)狀物數(shù)量非常多，輕微活動(dòng)，細(xì)胞雖然可以生長(zhǎng)但繁殖速度卻明顯減慢，而且細(xì)胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細(xì)胞不透亮。他們與細(xì)胞可共生但會(huì)與細(xì)胞爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)。這種共生是非常普遍的，但他們的數(shù)量小，細(xì)胞站優(yōu)勢(shì)所以不會(huì)影響到細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量時(shí)就會(huì)影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)，終形成惡性循環(huán)。

病毒污染

組織細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，如果沒(méi)有除去潛在的病毒，就會(huì)產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。 盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。

交叉污染

共用試劑、耗材，同時(shí)操作不同的樣本，都極易造成交叉污染。交叉污染王應(yīng)該屬于HeLa細(xì)胞了，世界上已有很多細(xì)胞都受其污染，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無(wú)效。

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